安諾辣椒全長轉錄組文章熱辣來襲!

來源: 安諾基因   2019-4-29   訪問量:1021評論(0)

天然反義轉錄本(NAT)通常指天然情況下生物體內生成的反義RNAs,它們可以與有義轉錄本形成dsRNA,調節有義鏈的表達。因對基因組注釋水平要求較高,此前植物NAT的研究主要集中在模式植物上,尚缺少對茄科植物的報道。日前,華中農大與湖南省農科院聯合在The Plant Journal(IF=5.775)上在線發表文章,研究辣椒發育和逆境反應中廣泛存在的NAT基因,安諾基因在本次研究中承擔了全長轉錄組測序的工作。

 


 

樣本選擇:不同處理、不同生長時期的辣椒組織。

 

測序策略:構建1-2 kb、2-3 kb、3-6 kb 3個不同片段大小的iso-seq文庫,共測序6個SMRT cells。

 

實驗設計

 

 

 

主要結果

 

PacBio測序構建辣椒全長轉錄組

研究中通過PacBio Iso-seq測序,共獲得了57,962條高質量全長轉錄本,其中48,785條轉錄本能夠比對到參考基因組“Zunla”上的18,368個基因。在新發現的轉錄本中,有3,887條來自于1,237個新基因的可變剪切事件,另外4,532條產生于新基因的組成型剪切(圖A)。全長轉錄組測序的優勢之一是可以獲得mRNA的完整UTR區域,對與參考基因組擁有相同CDS區域的全長轉錄本進行分析,新測得的5’和3’UTR分別最高可達100 nt和250 nt,遠遠高于參考基因組的平均50 nt(圖DE),這表示全長轉錄組測序可以捕獲更多完整的基因結構。

 

 

 

辣椒全長轉錄本分析圖[1]

基因模型修正

此前辣椒的基因注釋主要基于短讀長測序,對低表達基因外顯子的覆蓋度不夠,導致一些基因模型的構建呈片段化。本研究中利用PacBio測序修正了近500個注釋錯誤,使片段化的基因模型趨于完整,被修正的模型多數含有較多的外顯子或較長的內含子區域(圖AB),如新基因模型Capana00g004522.3可編碼完整的DNA拓撲異構酶6 subunit B(1-673aa),但舊模型中是由兩段基因分別編碼部分多肽,且中間被一段43 kb的內含子相隔。

作者隨機選取了26個新的基因模型,其中21個通過RT-PCR得到了驗證(圖C)。隨后作者將更新后的基因注釋文件,共包含41,105個基因模型的信息上傳至PepperHub (http://pepperhub.hzau.edu.cn/pegnm/),并開放訪問。

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片段化基因模型修正圖[1]


辣椒NAT基因鑒定與表達分析

研究中通過全長轉錄組測序共獲得2,057個cis-NAT,僅1,163個是已注釋轉錄本。基于轉錄方向和重疊方式,這些cis-NAT可分為頭對頭、尾對尾和完全重疊三種類型,前兩類大多數含有外顯子重疊區域,而第三類中不含外顯子重疊區域的cis-NAT占比更多,主要源于長內含子的存在(圖A)。在對trans-NAT的分析中(圖B),共鑒定到5,880個基因的34,193個trans-NAT。

 

一條轉錄本可以與很多其他轉錄本形成trans-NAT,研究人員將它們按照序列互補性分成了635組(圖C)。這些基因中55.1%的互補序列都來源于轉座子,而擬南芥中36.5%的trans-NAT互補序列從轉座子中獲取。通過對小RNA進行富集分析,發現由小RNA介導的調控機制可能對NAT基因的表達產生較大的影響。

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NAT基因鑒定與表達分析圖[1]

cis-NAT與trans-NAT功能分析

通過分析NAT的表達模式,發現27個cis-NAT和81個trans-NAT subgroup參與辣椒的多種生物過程。如由Capana02g003489 基因(cis-NAT)編碼的FDH1涉及水楊酸信號傳導和R基因介導的抗病性;辣椒果皮發育中,trans-NAT subgroup 1 的1-3號基因下調而4-11號基因發生上調(圖AB);subgroup2和3涉及與溫度有關的調控功能,而subgroup4中的很多基因涉及辣椒種子的發育(圖C)。

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cis-NAT與trans-NAT功能分析圖[1]

cis-NAT進化分析

為研究cis-NAT的進化歷程,研究人員對擬南芥(ATH)、煙草(NTA)、辣椒(CAN)、馬鈴薯(STU)和番茄(SLY)進行了比較分析并構建了系統進化樹(圖A),發現在進化中cis-NAT的丟失主要源于基因間區序列的增加(圖B),而新cis-NAT的形成主要源于轉座子的插入(圖CD)。

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cis-NAT進化機制分析圖[1]

 

 

文章亮點

本次研究利用全長轉錄組測序提高了辣椒基因組的注釋水平,重點是完成了對UTR的精準注釋。研究者在基因組范圍內進行茄科植物的cis-NAT特點及進化分析,發現轉座子可能參與新的cis-NAT形成。進一步的功能分析結果暗示NAT參與辣椒多種生物學過程,可能在辣椒素的合成中發揮重要功能。本文為研究辣椒的功能基因組學提供了新思路。

 

參考文獻

 

[1] Wang Jubin, Deng Yingtian, Zhou Yingjia, Liu Dan, Yu Huiyang, Zhou Yuhong, Lv Junheng, Ou Lijun, Li Xuefeng, Ma Yanqing, Dai Xiongze, Liu Feng, Zou Xuexiao, Ouyang Bo, Li Feng, (2019). Full-length mRNA sequencing and gene expression profiling reveal broad involvement of natural antisense transcript gene pairs in pepper development and response to stresses., Plant J., undefined.



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